Badanie ANA cz.2 (ELISA, Immunoblot)

Jak już było to opisane w poprzednich artykułach badanie ANA ma bardzo duże znaczenie w diagnostyce chorób autoimmunologicznych. Rekomendacje dotyczące diagnostyki ANA jednoznacznie zalecają dwuetapową diagnostykę i potwierdzanie wszystkich pozytywnych ANA drugą niezależną metodą. Immunofluorescencja pośrednia (IIFT) stanowi pierwszy etap diagnostyki, tzw. etap przesiewowy i została uznana za złotyt standard w diagnostyce ANA. Drugi etap badanie ANA stanowią testy potwierdzające i różnicujące, w których oznacza sie specyficzność antygenową badanych przeciwciał. Drugi etap diagnostyki opiera się o testy monospecyficzne typu ELISA czy Immunoblot.

W diagnostyce laboratoryjnej autoprzeciwciał testy monospecyficzne (ELISA, Immunoblot) uzywane są najczęściej jako:

• testy potwierdzające pozytywny wynik testu IIFT
• testy różnicujące pozytywny wynik testu IIFT.

ELISA – badanie ANA cz.2

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest testem immunoenzymatycznym. W zależności od celu, któremu ma służyć, może być testem monospecyficznym (opartym na pojedynczym antygenie) lub multispecyficznym (opartym na mieszaninie antygenów). W niektórych przypadkach są one jedynym dostępnym badaniem, np. dla przeciwciał anty-CCP w diagnostyce reumatoidalnego zapalenia stawów. Podstawą testu ELISA jest naniesienie oczyszczonego antygenu na dno studzienki mikrotitracyjnej. Test ELISA służy do ilościowego lub półilościowego oznaczania specyficznych przeciwciał wybranej klasy (IgG, IgM, IgA) przeciwko wybranemu antygenowi. Technika ta wykorzystywana jest najczęściej do potwierdzenia obecności pojedynczych antygenów przy rozpoznawaniu schorzeń autoimmunologicznych oraz monitorowania postępu leczenia.

Immunoblot – badanie ANA cz.2

Immunoblot jest monospecyficznym testem immunoenzymatycznym. Testy monospecyficzne opierają się na ograniczonej liczbie antygenów. Podstawą testu Immunoblot jest naniesienie oczyszczonych antygenów w postaci cienkich, równoległych linii na membranach nitrocelulozowych. Każdy prążek to inny opisany i biochemicznie scharakteryzowany antygen. Wybarwienie się poszczególnych pasm świadczy o obecności konkretnych autoprzeciwciał. Obecnie dostępnych jest wiele profili z różnym składem antygenowym. Test Immunoblot służy do jakościowego oznaczania specyficznych przeciwciał wybranej klasy (IgG, IgM, IgA) przeciwko wybranym antygenom.

Zasada działania testu immunoenzymatycznego

1. W pierwszym etapie badanie ANA antygen (na dnie studzienki mikrotitracyjnej lub naniesiony na membranie nitrocelulozowej) inkubuje się z odpowiednio rozcieńczoną surowicą pacjenta. Jeżeli w badanej próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, dochodzi wówczas do reakcji antygen–przeciwciało.
2. W drugim etapie dodawany jest roztwór przeciwciał antyludzkich znakowanych enzymatycznie (koniugat).
3. W trzecim etapie obserwuje się barwną reakcję, którą zatrzymuje się poprzez: dodanie roztworu stopującego (ELISA) lub odpłukanie koniugatu (Immunoblot).